RNA-gerichte therapie voor epidermolysis bullosa – naar de kern

Artikel in PDF

Recessieve dystrofische epidermolysis bullosa (RDEB) is een erfelijke huidaandoening die wordt gekenmerkt door ernstige blaarvorming van huid en mucosa. Er is geen therapie beschikbaar en behandeling beperkt zich tot symptoombehandeling. Een veelbelovende categorie van therapieën richt zich op het RNA. Exon skipping is een RNA-gerichte therapie die gebruikmaakt van korte synthetische RNAsequenties (antisense oligonucleotiden: AON’s) die kunnen worden toegediend om op RNA-niveau de mutatie die de ziekte veroorzaakt te excluderen. De meest ernstige variant van epidermolysis bullosa, RDEB-generalized severe (-gen sev), wordt veroorzaakt door stopmutaties in het COL7A1-gen die resulteren in de volledige afwezigheid van het type VII-collageeneiwit1 . Patiënten met RDEB-gen sev sterven vroegtijdig door complicaties van de ziekte. Eerder onderzoek liet een sterke correlatie zien tussen de hoeveelheid type VII-collageeneiwit in de huid en de ernst van het ziektebeeld.2 In deze studie onderzochten we de potentie van AON-gemedieerde exon skipping als therapie voor RDEB-gen sev. Door herexpressie van het type VII-collageen te induceren is het doel om het klinisch beeld te verbeteren. De methode van AON-gemedieerde exon skipping wordt ook wel splicemodulatie genoemd. Splicing vind plaats in de celkern en is het proces waarbij de niet voor eiwitcoderende sequenties (intronen) van het RNA worden verwijderd en de voor eiwitcoderende sequenties (exonen) uiteindelijk het volwassen messenger RNA vormt. Doordat de AON’s specifiek aan het RNA binden, blokkeren ze hiermee specifiek splicesignalen van het exon, waarin zich de ziekteveroorzakende mutatie bevindt. De stop mutatie zal daardoor niet langer deel uitmaken van het RNA en er ontstaat een iets korter eiwit dat zijn functionaliteit grotendeels behoudt.3 Het COL7A1-gen is zeer geschikt voor exon skipping vanwege de structuur van type VII-collageen (figuur 1). Het is opgebouwd uit grofweg drie domeinen, het niet collagene domein 1 (NC1), het triple helixdomein (THD) en het niet collagene domein 2 (NC2).4 Het THD is voor het grootste deel opgebouwd uit een glycineherhaling (Gly-X-Y). Na translatie, dat wil zeggen de vertaling van mRNA naar eiwit, vormen drie type VII-collageen pro-eiwitten een triple helix. Na trimerisatie vindt antiparallelle dimerisatie plaats van de carboxylterminus, waarbij een deel van het NC2-domein wordt verwijderd. Het resultaat is een triple helix omringd door twee NC1- trimeren. Deze volwassen type VII-collageeneiwitten clusteren en verbinden de lamina densa aan de papillaire dermis. Interessant voor exon skipping is dat het hele THD wordt gecodeerd door kleine in-frame exonen zodat bij skipping het THD slechts enigszins korter wordt. Omdat zowel huid als slijmvliezen zijn aangedaan bij RDEB, zou het ideaal een systemische therapie zijn die zowel de huid als de slijmvliezen behandelt.

Resultaten

Selectie van exonen die in aanmerking komen voor exon skipping
Om de toepasbaarheid van exon skipping in het COL7A1-gen in kaart te brengen is het COL7A1-gen (NM_000094.3) geanalyseerd. Voor het overzicht zijn alle 118 exonen weergegeven in figuur 1. In figuur 1 is het leesraam aangegeven en zijn alle skipbare en niet-skipbare exonen weergegeven. Het THD codeert voor het grootste gedeelte een glycineherhaling die op 19 plaatsen onderbroken wordt.

Deze glycineherhaling maakt de vorming van een triple helix mogelijk. In het figuur zijn de exonen die een perfecte glycineherhaling coderen aangegeven (donkergroen). Deze exonen zijn interessant voor exon skipping omdat het verwijderen ervan niet leidt tot een aminozuurverandering en de glycineherhaling zal niet worden verstoord. Voor deze studie is exon 105 gekozen als target, omdat primaire keratinocyten en fibroblasten van een patiënt met RDEB-gen sev beschikbaar waren. De patiënt is drager van de homozygote c.7828C>T, p.Arg2610Ter-mutatie in exon 105. Deze nonsense mutatie leidt tot een vroegtijdig stopcodon en de volledige afwezigheid van type VII-collageen in de huid (figuur 2). Exon 105 is 81 bp lang, en codeert precies voor negen glycine-x-y-herhalingen.

In-vitro-exon skipping leidt tot herexpressie van type VII-collageen
Alle 1134 mogelijke AON’s voor exon 105 zijn geanalyseerd op smelttemperatuur (Tm), GC-percentage, bindingenergie en specificiteit. De sequentie van exon 105 is eveneens geanalyseerd op splicesignalen. 2 AON’s zijn geselecteerd en gesynthetiseerd als 2’-O-Methyl phosphorothioates (figuur 3a). Door middel van RT-PCR van exon 102-108 is het effect op splicing geanalyseerd. De combinatie van beide AON’s in een concentratie van 250 nM liet de beste resultaten zien (figuur 3b). Deze combinatie werd gebruikt in verdere experimenten. Controle- en RDEB-patiëntencellen (keratinocyten en fibroblasten) werden vervolgens gekweekt en getransfecteerd met de twee AON’s. Exon 105-skipping werd geobserveerd en bevestigd met Sanger sequencing (figuur 3c). Om de novo expressie van type VII-collageen te onderzoeken werden patiëntencellen 72 uur na transfectie met immunofluorescentie (IF) geanalyseerd. IF liet, zoals verwacht, zien dat onbehandelde patiëntencellen volledig negatief waren voor type VII-collageen. Na transfectie vormden patiëntenkeratinocyten en -fibroblasten respectievelijk 50% en 10% type VII-collageeneiwit in vergelijking met gezonde controlekeratinocyten (100%) en fibroblasten (30%) (figuur 3d). Om de grootte van dit type VII-collageeneiwit te onderzoeken werd vervolgens westernblot gedaan. Zoals in figuur 3e te zien is, heeft het eiwit de verwachte lengte, en is het niet afgebroken in kleinere fragmenten. Daarnaast laat dot-blotanalyse van het medium zien dat het eiwit door de cellen kan worden uitgescheiden (figuur 3f). Dit is een belangrijke observatie, omdat uitscheiding door de cellen essentieel is voor de functie van het extracellulaire type VII-collageen.

Systemisch geïnduceerde exon skipping en restoratie van eiwitsynthese in vivo
Om het systemische effect van onze AON’s en daar mee de klinische toepasbaarheid te onderzoeken, werden de AON’s in een in-vivosetting getest. Op de rug van zes muizen werd patiëntenhuid gegraft. De muizen ontvingen vijfmaal per week acht weken lang subcutane injecties distaal van de graft (figuur 4a). Na acht weken behandeling werden de grafts geoogst, ingevroren en geanalyseerd voor exon skipping en type VII-collageen expressie. RT-PCR liet skipping van exon 105 zien in grafts van muizen behandeld met de AON’s (figuur 4b). Hiermee werd aangetoond dat de AON’s een systemisch effect op RNA-niveau induceerden. Om het effect op eiwitniveau te onderzoeken werden parallel cryosecties gekleurd met LH7.2, specifiek voor humaan type VII-collageen. In tegenstelling tot onbehandelde patiëntengrafts werd de novo expressie van type VII-collageen geobserveerd in behandelde patiëntengrafts (figuur 4c). Om de integriteit en structuur van de basale membraanzone (BMZ) te onderzoeken, werd daarnaast IF uitgevoerd voor type IV-collageen, een belangrijk component van de lamina densa van het BMZ. IF liet een verwijde aankleuring zien in onbehandelde patiëntengrafts dat een desorganisatie van het BMZ indiceert (figuur 4d). Bij behandelde patiëntengrafts werd dit niet gezien en is de aankleuring vergelijkbaar met controlegrafts, wat functionaliteit van het resulterende eiwit aangeeft.

Discussie

In deze studie hebben we een stap gezet richting klinische toepassing door AON-gemedieerde exon skipping te onderzoeken als systemische therapie voor RDEB. Onze in-vivodata laten voor het eerst systemische exon skipping in het COL7A1-gen zien. Eerdere onderzoeken lieten ook de potentie zien
van antisense oligonucleotiden voor de behandeling  van andere ziekten, bijvoorbeeld duchennespierdystrofie en spinale musculaire atrofie, veroorzaakt respectievelijk door mutaties in het DMD-en het SMN1-gen.5,6 Dit heeft geleid tot de recente goedkeuring door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) van twee medicijnen: eteplirsen, een exon skipping therapie voor exon 51 van het DMD-gen, en nusinersen, een AON die er voor zorgt dat exon 7 van het SMN2-gen juist wordt geïncludeerd in het mRNA zodat het SMN2-gen wordt omgezet naar een analoog van het SMN1-gen. Belangrijk is om na te gaan of het gevormde, kleinere type VII-collageen na behandeling met onze AON’s dezelfde functionaliteit heeft als het eiwit van wildtype lengte. Bornert et al. toonden aan dat de functionaliteit van het type VII-collageen niet wordt aangedaan door het skippen van exon 105 in verschillende functionele tests.3 Zo bleef de binding met de bindingspartner type IV-collageen gelijk. Ook werd de migratie van fibroblasten en triple helix-formatie niet gehinderd door het verwijderen van exon 105. Ook werd in vivo het type VIIcollageen zonder exon 105 correct ingebouwd in de BMZ en stimuleerde daar de stabiliteit van de huid. Of fibroblasten of keratinocyten verantwoordelijk zijn voor de herexpressie van het type VII-collageen blijft nog een vraagstuk. Dit is een belangrijke vraag, omdat de basale keratinocyten een hogere expressie van type VII-collageen laten zien dan dermale fibroblasten. Echter, injecties met type VIIcollageenproducerende fibroblasten resulteren in een verbetering van het klinisch beeld.7 Daarnaast is met injecties van type VII-collageen in hypomorfe muizen aangetoond dat ongeveer 35% type VIIcollageen voldoende is om blaren te voorkomen. In combinatie met de sterke correlatie tussen de hoeveelheid type VII-collageen en de ernst van het klinisch beeld wordt verwacht dat ook kleine hoeveelheden herexpressie klinisch relevant zullen zijn en resulteren in een verbetering van het ziektebeeld. Er zijn inmiddels meer dan 435 mutaties beschreven die leiden tot RDEB (www.deb-central.org). Van deze mutaties ligt ongeveer 38% in Gly-X-Ycoderende exonen. In het meest gunstige geval zou theoretisch dus 38% (165) van de patiënten behandeld kunnen worden. Echter, hoeveel patiënten met RDEB er daadwerkelijk behandeld kunnen worden met exon skipping moet nog worden onderzocht. Dat heeft voornamelijk te maken met welke exonen in aanmerking komen voor exon skipping en ook welke patiëntengroepen in aanmerking komen. Allereerst zal de focus liggen op de ernstig aangedane patiënten met RDEB-gen sev omdat kleine hoeveelheden eiwit al significante verbetering van het klinisch beeld kunnen geven. Er zullen ook exonen zijn die om praktische redenen niet geskipt kunnen worden, bijvoorbeeld doorat de sequentie van een exon of de intron-exon-overgang het niet toelaat AON’s in die regio te ontwikkelen. Ook zullen sommige exonen essentieel zijn voor de functie van het eiwit en zal skipping leiden tot een niet functioneel eiwit. Exon skipping zal dus een gepersonaliseerde therapie worden die voor elk exon afzonderlijk ontwikkeld zal moeten worden. Er zijn echter wel zogeheten hotspots voor mutaties, zoals exon 13 en exon 80.8,9 Deze zijn interessant om te onderzoeken, omdat hiermee een grotere groep patiënten geholpen zou kunnen worden. Hoe vaak de patiënten vervolgens behandeld moeten worden en via welke toedieningswijze is nog onbekend. Het toedieningsinterval zal afhankelijk zijn van de stabiliteit van het gevormde mRNA en het resulterende eiwit. Dit zou wekelijks kunnen zijn, zoals eteplirsen10, of zelfs maandelijks. In onze studie zijn AON’s subcutaan toegediend in muizen. In klinische trials voor duchennespierdystrofie werden ernstige injectiesitereacties gerapporteerd na subcutane injecties. Deze reacties ontstonden tegen de chemische modificatie van de AON’s. Om die reden werd ook besloten eteplirsen intraveneus te gaan toedienen. Deze reacties ontstaan niet bij intraveneuze toediening en toekomstige systemische toediening voor epidermolysis bullosa zal zich daarom ook focussen op de intraveneuze route. Onze studie is een eerste stap in de richting van AON-gemedieerde exon skipping als therapie voor RDEB-sev gen.

Literatuur

1. Fine JD, Bruckner-Tuderman L, Eady RA, Bauer EA, Bauer JW, Has C, et al. Inherited epidermolysis bullosa: updated recommendations on diagnosis and classification J Am Acad Dermatol 2014;70:1103-26.
2. van den Akker PC, van Essen AJ, Kraak MM, Meijer R, Nijenhuis M, Meijer G, et al. Long-term follow-up of patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa in the Netherlands: expansion of the mutation database and unusual phenotype-genotype correlations. J Dermatol Sci 2009;56:9-18.
3. Bornert O, Kuhl T, Bremer J, Van Den Akker PC, Pasmooij AM, Nystrom A. Functional evaluation of targeted exon deletion reveals prospect for dystrophic epidermolysis bullosa therapy. Mol Ther 2016; doi: 10.1038/mt.2016.92
4. Burgeson RE, Morris NP, Murray LW, Duncan KG, Keene DR, Sakai LY. The structure of type VII collagen. Ann N Y Acad Sci 1985;460:47-57.
5. Sivanesan S, Howell MD, Didonato CJ, Singh RN. Antisense oligonucleotide mediated therapy of spinal muscular atrophy. Transl Neurosci 2013; doi: 10.2478/s13380-013- 0109-2.
6. Kole R, Krieg AM. Exon skipping therapy for Duchenne muscular dystrophy. Adv Drug Deliv Rev 2015; doi: 10.1016/j.addr.2015.05.008.
7. Kern JS, Loeckermann S, Fritsch A, Hausser I, Roth W, Magin TM, et al. Mechanisms of fibroblast cell therapy for dystrophic epidermolysis bullosa: high stability of collagen VII favors long-term skin integrity. Mol Ther 2009;17:1605-15.
8. Mohammedi R, Mellerio JE, Ashton GH, Eady RA, McGrath JA. Clin Exp Dermatol 1999;24:37-9.
9. Escámez MJ, García M, Cuadrado-Corrales N, Llames SG, Charlesworth A, De Luca N, et al. The first COL7A1 mutation survey in a large Spanish dystrophic epidermolysis bullosa cohort: c.6527insC disclosed as an unusually recurrent mutation. Br J Dermatol 2010;163:155-61.
10. https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2016/206488lbl.pdf

11. Goemans NM, Tulinius M, van den Hauwe M, Kroksmark AK, Buyse G, Wilson RJ, et al. Long-Term Efficacy, Safety, and Pharmacokinetics of Drisapersen in Duchenne Muscular Dystrophy: Results from an Open-Label Extension Study. PLoS One 2016; doi: 10.1371/journal.pone.0161955.

Gemelde (financiële) belangenverstrengeling
De Rijksuniversiteit Groningen heeft een patent ingediend op het gebied van exon skipping als therapeutische toepassing voor dystrofische epidermolysis bullosa.

Disclosure
The figures used in this manuscript were previously published by Bremer et al., in Molecular Therapeutics-Nucleic Acids (DOI: 10.1038/mtna.2016.87) under the license: Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International.

Correspondentieadres
J. Bremer
UMCG
Afdeling Dermatologie
Hanzeplein 1
9713 GZ Groningen,
Tel.: 050-3612520
E-mail: j.bremer@umcg.nl